1. 실험 목적 빛 에너지를 통해 식물이 명반응과 암반응을 통해 광합성하는 과정을 이해하고 탄소를 어떻게 고정하고 사용하는지 관찰할 수 있다.
2. 실험 이론 (1) 광합성 (2) 명반응 (광의존반응) (3) 암반응 (광독립반응) (4) 가스교환 실험 이론 (5) 흡광도 측정 이론
3. 실험 방법 (1) 명반응 실험
시약 조사 다이클로로페놀인도페놀(DCPIP 또는 DPIP)는 산화 환원 지시약으로 사용되는 화합물로 명반응에서는 NADP+대신 전자수용체 역할을 한다. DCPIP가 산화가 되었을 때는 파란색을 띠지만, 환원되어 DCPIPH2가 되면 무색이 된다. 이를 통해 흡광도를 측정할 수 있다.
인산완충식염수 (PBS) 용액은 완충용액으로 pH의 변화를 줄이기 위해 사용한다.
실험 절차 1. 2개의 15mL conical tube에 각각 ‘명조건’, ‘암조건’이라고 라벨링 한다. 2. 각 튜브에 PBS 2mL, 130μm DCPIP 2mL씩 분주한다. 3. 명조건과 암조건 튜브에 엽록체를 0.4mL씩 분주한다. 4. 암조건 튜브를 호일로 감싼다. 5. 비커에 얼음물을 채운 후 각 tube를 넣고 30분간 빛을 비춰준다. 6. 명조건 그리고 암조건 사이의 색을 비교한다. 7. 600nm에서 흡광도 값을 측정한다.
(2) 암반응 실험 시약 조사 에탄올은 잎의 엽록소를 빠져나오게 하여 잎을 탈색시키는 역할을 하고, Gram`s iodine은 요오드-녹말 반응에 의해 잎을 보라색으로 염색하는 역할을 한다.
실험 절차 1. 50ml 튜브 2개에 100% 에탄올을 20ml씩 분주한다. 2. 명처리 잎과 암처리 잎을 에탄올이 든 50ml 튜브에 넣고 95 ℃ 항온 수조에 15분간 중탕한다. 3. 페트리디쉬 위에 에탄올로 탈색한 잎을 놓고 Gram`s iodine으로 15분간 염색한다. 4. 요오드-녹말 반응에 의해 보라색이 나타나는지 확인한다.
(3) 기체교환 실험 시약 조사 페놀레드는 지시약으로 pH가 6.8 아래가 되면 노란색이 되고 8.2를 넘어가면 붉은색이 된다.
실험 절차 1. 검정말 하나를 반으로 잘라 두 개의 튜브에 각각 넣는다. 2. 공기방울이 들어가지 않게 0.003% 페놀레드가 함유된 증류수를 가득 넣고 마개를 닫는다. 3. 하나는 호일로 감싸 빛을 차단하고, 생장상에 하루 정도 배양한다. 4. 다음날 용액의 색 변화와 기체 포집 여부를 관찰한다.
4. 고찰 이번 실험은 광합성의 전반적인 과정을 이해하고 광합성의 조건을 확인하는 실험이었다. 광합성은 명반응과 암반응으로 구분할 수 있다. 명반응은 틸라코이드 막의 광계를 통해 빛에너지를 화학에너지로 바꿔 ATP와 NADPH를 합성하는 반응이다. 암반응은 빛 의존성이 없어 ATP, NADPH, CO2을 가지고 스트로마에서 유기물을 합성하는 반응이다. 이러한 반응들의 특징을 확인하기 위해 명반응 실험, 암반응 실험, 기체교환 실험을 하였다. 명조건 실험은 명반응에서 NADP+대신 전자수용체 역할을 하는 DCPIP 수용액을 사용해 DCPIP가 환원되면 청록색에서 무색으로 바뀌는 특징을 이용하는 실험이다. 그 결과 명반응 튜브는 암반응 튜브보다 옅은 색을 띠었다. 이는 DCPIP가 환원되어 무색이 되었음을 알 수 있다. 또한, 명반응의 흡광도는 x였고, 암반응의 흡광도는 xnm로 명반응의 DCPIP이 환원되었음을 알 수 있다. 이를 통해 빛의 여부에 따라 명반응이 일어남을 확인했고, 명반응을 통해 NADPH, ATP가 만들어짐을 간접적으로 확인할 수 있었다. 암조건 실험은 명처리한 잎과 암처리한 잎을 에탄올로 엽록소를 빠져나오게 하여 탈색시고, Gram`s iodine은 요오드-녹말 반응에 의해 잎을 보라색으로 염색한다. 명처리한 잎은 전체적으로 검은 반점이 많아 명반응과 암반응이 계속 일어나 녹말을 다량 생성한 것을 알 수 있었다. 암처리한 잎은 명반응은 일어나지 않지만, 암반응이 계속 일어나 명반응에서 생성하는 ATP와 NADPH가 부족해 암반응이 지속적으로 일어나지 않았기에 녹말을 상대적으로 미량 생성할 수밖에 없었다. 저 실험 사진에는 암처리한 잎이 여러 개 겹쳐져 있어 어둡게 보이지만 검은 반점이 거의 없는 것을 확인할 수 있다. 기체교환 실험은 검정말을 0.003% 페놀레드가 함유된 증류수를 가득 넣은 튜브에 넣어 하나는 호일에 감싸 빛을 받지 못하도록 하고 하나는 그대로 두어 기체교환을 확인하는 실험이다. 호일로 감싼 튜브는 광합성에서 암반응이 ATP와 NADPH의 공급이 없어 짧게 일어났을 것이며, 잎에서 세포 호흡은 지속되었을 것이다. 이에 따라 CO2농도가 증가함에 따라 실온에서 이산화탄소의 용해는 1,449 mg/L로 물에 잘 녹아 H2CO3인 탄산을 생성해 산성을 띠게 되어 호일로 감싼 튜브의 색깔이 페놀레드에 의해 노란색을 띠었다. 반면에 호일로 감싸지 않은 튜브는 명반응과 암반응의 광합성이 지속적으로 일어나고 호흡을 지속적으로 한다. 그러나 광합성의 양이 호흡의 양보다 많기 때문에 튜브 안에 있는 CO2와 물에 용해되었던 CO2를 모두 사용해 광합성을 하기 때문에 튜브 안 용액은 염기성을 띤다. 그래서 페놀레드에 의해 용액이 붉은색을 띠는 것을 확인할 수 있었다. 이번 실험들을 통해 광합성의 전반적인 과정을 이해해 암반응에서 탄소 고정을 해 유기물을 만든다는 것과 명반응에서 ATP와 NADPH를 만든다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 명반응에서 물의 광분해를 통해 O2를 부산물로 생성하고, 암반응에서 탄소고정을 통해 CO2를 소모하는 것은 식물의 중요성을 깨닫게 해준다. 사람을 포함한 종속영양생물은 산소 없이 스스로 ATP를 합성할 수 없고, CO2를 방출할 뿐이다. 현재 지구 온난화가 가속되고 있어 온실 기체 감축의 필요성이 전세계적으로 대두된다. 온실 기체를 줄이기 위해 화학적으로 공기중의 CO2를 고체로 만들거나 화석연료가 아닌 환경 에너지를 사용하려 하지만 기본적으로 독립영양생물인 식물을 보존해 공기 중의 CO2를 줄여야 한다는 중요성을 일깨워준다. 이를 통해 이산화탄소의 균형을 맞추기 위한 광합성의 과정을 이해하고 숲의 파괴를 막아야함을 이번 실험을 통해 알 수 있다.
