효소 반응 실험 보고서 (고찰)

 

1.   실험 목적

 효소의 활성 조건을 확인하고 환원당 정량법(Somogy-Nelson)를 통해 환원당 생성 여부를 측정할 수 있다.

 

2.   실험 이론

(1) 단백질

(2) 효소

(3) 환원당과 비환원당

(4) 흡광도 측정 이론

 

3.   실험 방법

(1) pH에 따른 전분의 가수분해

 

1. 15mL 튜브의 몸통과 뚜껑에 각 buffer를 라벨링한다.

2. 각각 3개의 15mL 튜브에 전분을 넣은 bufferⅠ(pH 7.3), bufferⅡ (pH 2.7), bufferⅢ (pH 10)을 각각 1 mL씩 분주한다.

3. 각각의 튜브에 3.0% α-amylase 용액 1mL씩 분주한다.

4. 10초간 볼택싱을 한 후 95 ℃ 항온 수조에서 10분간 반응한다. 이 때 반응이 잘 진행되도록 3분 간격으로 2번 섞는다.

 

(2) 온도별 전분의 가수분해

 

1. 15mL 튜브의 몸통과 뚜껑에 4 ℃, 37 ℃, 95 ℃를 라벨링한다.

2. 각각 3개의 15 mL 튜브에 전분을 넣은 bufferⅠ을 10번 invert mix한 후 각각 1 mL씩 분주한다.

3. 각각의 튜브에 3.0% α-amylase 용액 1 mL를 분주한다.

4. 10초간 볼택싱을 한 후 냉장고 4℃인 얼음물과 37℃와 95℃로 세팅된 항온 수조에서 10분간 반응한다. 이 때, 반응이 잘 진행되도록 3분 간격으로 2번 섞는다.

 

(3) 환원당 측정

 

1. 9개의 15mL 튜브를 준비하여 6개의 튜브의 몸통과 뚜껑에는 pH 3개와 온도 3개를 라벨링하고 나머지 3개에는 1 % glucose, 무처리 전분, blank를 라벨링한다.

2. 각 15mL 튜브에 증류수 250μL씩 분주한다.

3. 반응이 끝난 7개의 튜브의 상층액에서 250μL씩 취해 증류수를 분주해 둔 각 튜브에 넣는다.

4. 남은 3개의 튜브에는 대조구로 1 % glucose 용액, 무처리 전분, 증류수를 각각 250μL씩 넣는다.

5. 9개의 튜브에 적정용액 D(적정용액 A 12.5mL + 적정용액 B 0.5mL)를 1mL씩 넣고 10초간 볼텍싱 한다.

6. 95℃ 로 설정된 항온 수조에서 10분간 끓인다.

7. 실온에서 5분 정도 식힌 후 적정용액 C를 500μL씩 넣고 10초간 볼텍싱한다.

8. 실온에서 5분간 반응시킨다.

9. 9개의 튜브에 증류수 5mL씩 넣어 희석한 후 (invert mix 10번) 각 튜브에서 1mL씩 취해 큐벳에 넣는다.

10. UV/VIS spectrophotometer를 520nm로 설정하고 증류수만 넣은 시료를 blank로 설정한 뒤 나머지 8개의 시료를 측정한다. (큐벳의 화살표 방향을 기준으로 광원이 통과되게끔 유의하여 측정한다.)

 

5.   고찰

 이번 실험은 효소의 활성 조건을 알아보고 환원당의 성질을 알고 Copper-Reduction법을 통해 색깔 관찰 및 흡광도를 분석하는 실험이다. 효소는 물질대사의 활성화 에너지를 낮추고 반응속도를 높이기 위해 전이 상태를 안정시키는 등의 역할을 하는 생체 촉매이다. 효소는 단백질로 이루어져 단백질의 구조와 비슷하고, 단백질의 변성이 일어나는 조건이 효소의 활성이 안 되는 조건과 비슷하다. 즉, 효소에는 최적 pH나 온도가 있으며, 활성 부위에 모양이 맞는 기질과만 결합하는 기질 특이성이 있다. 우리가 실험에서 사용하는 효소는 전분을 포도당으로 분해하는 효소들 중 뜨거운 곳에서 사는 고세균인 Bacillus amyloliquefaciens에서 추출한 α-amylase를 사용한다. 이 효소는 최적 온도가 약 90℃ 정도이며, pH7인 중성에서 잘 활성화가 되는 효소이다. 이 효소가 잘 활성화가 되는 조건을 알기 위해 pH2.7, pH7, pH10 튜브와 4℃, 37℃, 95℃ 튜브를 만들어 어느 조건에서 효소가 가장 잘 활성화가 되는지 알아보도록 실험하였다. 또한, α-amylase가 잘 활성화가 되었는지 보기 위해 Copper-Reduction 방법을 통해 전분에 비해 비교적 환원당인 포도당이 많으면, 환원당에 의해 만들어진 Cu+이 인몰리브덴산과 결합해 인몰리브덴산이 환원되어 청록색의 몰리브덴청의 많아져 짙은 청록색을 띠게 된다. 또한, 이를 이용해 흡광도의 변화를 측정할 수 있었다.

 이 실험 결과 pH7.3, 95℃, Glucose가 색이 진하고, Glucose가 흡광도 값이 낮게 나온 이유는 분광광도계가 *값으로 나와 1이상이라 보고 측정한 값이다. pH10에서 비교적 몰리브덴청이 많아 색이 진했고, 흡광도 값이 높게 나온 이유는 Bacillus amyloliquefaciens의 α-amylase가 생각 외로 높은 pH에 내성을 지녔기 때문이다. 이 효소의 최적 pH는 pH7일지라도 이 효소가 pH에 모양이 변하지 않고 기능이 일정 유지되기 때문에 pH10에서 반응이 일어났다고 생각한다. 따라서 예상했던 것과 같이 α-amylase가 최적 온도와 pH인 pH7.3, 95℃에서 반응이 잘 일어났고, pH10에서 효소가 반응을 잘해 효소를 활용할 때는 효소가 어느 부분에서 변성이 되는지 어느 정도의 내성이 있는지 조사해야 한다고 느꼈다.

 이번 실험을 통해 효소의 활성 조건과 활성화가 된 결과를 직접 눈으로 관찰하였다. 그리고 주로 박테리아의 인슐린 생성 과정이 이 효소의 합성과 활성에 관련이 있다고 생각한다. 사람의 인슐린 합성 효소 DNA를 박테리아의 플라스미드에 삽입하여 박테리아가 사람의 인슐린 합성 효소를 만들어 이 효소를 활성시키는 조건을 만들어 인슐린을 생산한다. 이 과정에서 DNA를 통해 효소를 조합해 유용물질을 대량생산하기 위해 이 활성 조건이 잘 맞아야 한다. 박테리아가 효소를 생산해 이 효소가 물질을 만들기 위해 어떤 기질이 필요하고 활성 조건을 찾고 만들어진 유용 물질을 어떻게 분류하고 정제할 것인지 알아야 한다. 이러한 효소의 특성을 이해하고 응용하면, 효소에 의해 만들어지는 물질을 대량 생산할 수 있을 뿐만 아니라 박테리아에 의해 만들어진 효소를 정제하여 효소 자체를 바이오 물질로 사용해 인체에 이로운 작용을 할 수 있다고 생각한다.

효소의 특징 및 반응을 고찰에 추가 서술