DNA(Plasmid) extraction과 transformation(형질전환) 개념 정리

 

흔히 하는 분자생물학 실험 중에서 Plasmid를 mini-prep을 통해 transformation하는 실험을 진행합니다. 실제로 유용한 실험이며, 있어 보이는 기본적인 실험입니다. 이 transformation 과정에서 어떤 개념이 사용되는지 간략하게 나름대로 정리해봤습니다. 이 개념들만 추가적으로 잘 숙지하면, PCR 등의 분자생물학 실험을 깊이있게 진행할 수 있을 것입니다.

 

DNA 특징

Deoxyribonucleic acid는 두 개의 폴리뉴클레오티드 사슬 로 구성된 중합체이다. 발달, 기능, 성장 및 발달에 대한 유전적 지시를 전달하는 이중 나선을 형성하기 위해 서로 감겨 있다. 단백질 , 지질 및 복합 탄수화물(다당류)과 함께 핵산은 알려진 모든 형태의 생명체 에 필수적인 4가지 주요 거대분자 유형 중 하나이다. 2개의 DNA 가닥은 뉴클레오티드 더 단순한 단량체 단위로 구성되어 있기 때문에 폴리뉴클레오티드로 알려져 있다.

DNA 농도 및 순도

260nm/280nm에서의 DNA 흡광도 비율은 단백질(특히 방향족 아미노산)이 280 nm에서 빛을 흡수하기 때문에 단백질 용액의 DNA 오염을 평가하는 DNA 순도로 일반적으로 사용된다.

 

(DNA 농도) = (DNA A260 값) * (DNA 측정 상수 값) * (dilution rate)

핵산의 측정 상수 값
A260 dsDNA = 50μg/ml
A260 ssDNA = 33μg/ml
A260 ssRNA = 40μg/ml

DNA denaturation & renaturation 
Denaturation
DNA 복제, 전사, DNA 복구 또는 단백질 결합과 같은 생물학적으로 중요한 메커니즘이 발생하도록 설정된 경우 이중 나선은 열기에 의해 DNA 의 역평행 가닥 간의 비공유 결합인 H bond(수소 결합)가 끊어질 수 있다.

Renaturation
DNA renaturation은 ssDNA가 질소 염기의 상보적 수소결합을 다시 이루어 dsDNA가 되는 과정을 의미한다.

DNA extraction

DNA extraction은 기본적으로 cell lysis → binding → washing → elution 순서로 진행된다.

cell lysis
물리적인 세포 분쇄: 압착기, 고속 구슬 분쇄기 등
화학적인 세포 분쇄: 가수분해 효소, 동결 후 해동(freezing-thawing), 삼투압 충격법(osmotic shock) 등

DNA extraction
binding: spin column, magnetic beads 등 사용
washing: EtOH 등의 washing buffer
elution: elution buffer 

plasmid
plasmid는 세균에 있는 간단한 cloning vector로 세포 내의 작은 염색체외 DNA 분자다. plasmid를 통해 단백질 생산, 유전자 치료, 질병 모델에 사용할 수 있다.

plasmid 형태: 안정된 원형(relaxed circular), 선형(linear), 열린 원형(nicked open-circular), 변성된 초나선(supercoiled denatured), 닫힌 원형(supercoiled, or closed-circular)

Mini-prep
Mini-prep의 종류: Alkaline lysis, Boiling, Lithium 등

Alkaline lysis
Buffer S1: EDTA, glucose, Tris-Cl EDTA + RNase
Buffer S2: SDS, NaOH
Buffer S3: potassium acetate, Glacial acetic acid
Washing buffer, Elution buffer

Transformation
원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드를 vector로 침투해 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 발현되도록 조작하는 현상

제한효소
제한 효소는 회문(palindrome) 구조인 즉 양 사슬의 5'에서 3'방향으로 똑같은 염기서열을 인식해 DNA의 backbond인 phosphodiester bond를 절단한다.

Cloning Vector
유기체에서 안정적으로 유지될 수 있는 작은 DNA vector

Recombinant DNA
유전자 재조합의 실험실 방법에 의해 형성된 DNA 분자로 이 기술을 통해 키모신, 인슐린, 성장 호르몬, 혈액 응고 인자 VIII 등의 인간에게 유익한 물질들을 생산한다.

Component cell
bacteria에 외부 유전물질을 삽입시키기 위해 화학적 처리를 한 cell
Competent cell을 만드는 방법: Heat shock, Electroporation 등