DNA 추출 실험 보고서 (고찰)

 

1.   실험 목적

생물의 유전정보를 갖는 DNA의 구조를 이해하고 이에 따른 특성을 알 수 있다. 플라스미드의 특징을 이해하고, 플라스미드 추출 및 정제를 통해 DNA 추출의 원리를 알고, DNA의 생화학적 특징을 알 수 있다.

 

2.   실험 이론

(1)  핵산

(2)  뉴클레오타이드

(3)  DNA 구조

(4)  Major groove, Minor groove

(6)  원심분리기 (Cntrifuge)

(7)  젤 전기영동 (Electrophoresis)

 

 

3.   실험 방법

(1)  플라스미드 DNA 추출

1. 배양한 E.coli 세균을 원심분리하여 침전시킨다.

2. pellet에 Buffer ① 250μl를 넣고, 피펫으로 섞어준다.

3. Buffer ② 250μl를 넣고, 부드럽게 섞어준다.

4. 즉시 Buffer ③ 350μl를 넣고, 부드럽게 섞어준다.

5. 4 ℃, 13,000 RPM으로 원심분리를 5~10분 한다.

6. 맑은 상층액을 DNA binding column tube로 옮기고, 13,000 RPM에서 1분 간 원심분리 한다.

※  pellet, 찌꺼기 등이 섞이지 않도록 주의한다.

7. column을 분리하여 튜브로 내려온 액체를 버리고, column은 다시 끼운다.

8. Buffer ④ 700μl를 column의 벽을 따라서 넣고, 13,000 RPM으로 원심분리를 1분 한다.

9. 새로운 1.5ml 튜브로 column을 옮기고, 상온에서 1분 간 말린다.

10. Buffer ⑤ 50μl를 넣고, 13,000 RPM에서 원심분리를 1분 한다.

 

 

(2)  DNA 전기영동

1. 전기영동장치에 well comb을 끼우고 TAE Buffer을 채운 뒤, 아가로스 젤과 safe 젤을 넣는다.

2. 1kb size marker 2μl를 가장 왼쪽 well에 loading하고, cut DNA 12μl를 두 번째 라인에 loading한다.

※ loading을 할 때에는 피펫을 수직으로 적당한 깊이에 찔러서 넣어야 한다.

3. 추출한 DNA 10μl를 다른 라인에 loading한다.

4. 135V에서 25분 간 전기영동을 진행한다.

5. 전기영동장치에서 아가로스 젤을 빼서 트렌스일루미네이터로 옮긴다.

6. UV로 인해 보이는 DNA를 관찰한다.

 

 

5.   고찰

 이번 실험은 플라스미드 DNA를 추출하고, 전기영동으로 분리하는 실험이다. 순수한 플라스미드 DNA를 얻기 위해 여러 Buffer를 넣는다. 원심분리하여 얻은 세균에 글루코스, Tris-Cl, EDTA, RNase가 들어있는 buffer인 Resuspension Buffer를 넣는다. 글루코스는 삼투압을 일정하게 맞추는 작용, Tris-Cl은 pH를 일정하게 맞추는 완충용액 역할, EDTA는 세포벽에 작용하여 세포벽을 파괴하는 역할을 한다. Resuspension Buffer 의해 세균의 세포벽 부시고, RNA 제거한다. 이를 통해 DNA만 남게 만든다. 그 다음에 1% SDS, NaOH가 들어있는 buffer인 Lysis Buffer를 넣는다. EDTA이 파괴하지 못한 세포벽을 계면활성제와 지질로 이루어진 SDS가 이중막을 녹여 단백질이나 세포막을 녹이고 세포벽을 완전히 파괴한다. NaOH는 DNA를 강염기로 수소 결합을 끊고 변성시킨다. 그 다음에 넣는 Neutralization Buffer는 gDNA와 plasmid DNA를 분리하는 역할을 한다. Glacial acetic acid 강력한 산으로 전 단계에서 NaOH에 의해 염기성이 된 용액을 중화시켜 단일가닥 DNA를 재결합시키는 역할이다. 후에 넣는 Washing buffer와 Elution buffer는 각각 시약과 불순물을 추출해 순수한 플라스미드만 남게 세척하는 역할과 DNA의 추출을 돕는 역할을 한다. 이러한 과정을 통해 DNA를 추출하였다. 추출한 플라스미드 DNA는 선형(linear), 열린 원형(nicked open-circular), 초나선(supercoiled) 형태를 갖고 있다.

 아가로스 젤을 이용한 DNA 전기영동은 DNA가 인산기를 갖고 있어 음전하를 띠는 특성을 이용해 DNA를 분리하는 실험이다. 이번 실험에서 발암 물질인 EtBr 대신 safe 젤을 사용해 DNA를 관찰했다. TAE buffer와 DNA sample : 6X loading buffer = 5 : 1인 6X loading buffer를 넣는다. TAE buffer에는 Tris, 아세테이트, EDTA라는 세가지 성분으로 구성된다. Tris는 양이온을 공급하여 DNA를 더 잘 이동시킨다. 그러나 Tris는 pH가 11에 가까울 정도로 높기 때문에 아세테이트를 넣어 구성하여 아가로스 젤 전기영동을 했다.

 아가로스 젤의 전기영동 결과를 보면 한 곳에서만 플라스미드가 관찰되지 않았다. 그 이유는 DNA의 분자량이 같아도 DNA구조에 따라 전기영동 시 이동속도가 각각 다르게 나타나기 때문이다. 이는 아가로스를 통과할 때, 열린 원형(nicked open-circular)이 가장 느리고, 선형(linear), 초나선(supercoiled) 순서대로 이동속도가 빨라진다. 그 이유는 초나선은 플라스미드가 응축된 형태로 아가로스 젤을 통과하기 쉬웠고, 열린 원형은 둥근 모양으로 아가로스 젤에 저항을 많이 받게 된다. 그래서 실험 결과 safe 젤과 UV로 본 플라스미드 중 초나선(supercoiled) 형태의 플라스미드가 가장 멀리 이동했고, 약 3.1kbp의 marker와 같은 위치에 있었다. 비교적 흐리게 관찰된 플라스미드는 선형(linear) 형태의 플라스미드로 약 6.1kbp marker와 같은 위치에 있었다. 이론적으로 약 8kbp의 marker와 같은 위치에 있어야하는 열린 원형(nicked open-circular) 플라스미드는 너무 적은 양이라서 관찰이 안 되었다. 열린 원형(nicked open-circular)를 관찰하기 위해 전보다 실험을 더 정확하고 신속하게 수행해야 한다. 또한, 추출할 플라스미드의 양을 늘리고, safe 젤 대신 발암물질인 EtBr을 사용하면 열린 원형(nicked open-circular)를 관찰할 수 있을 것이다.

 아직 gDNA의 형태에 따른 기능의 다른 점을 정확히 알지 못한다. DNA의 기능을 이해하기 위해 DNA 형태에 따른 기능의 다른 점을 이해해야 한다. 이번 실험의 전기영동을 통해 DNA 구조를 확인해 DNA 형태를 고정시키고 다시 DNA를 주입해 DNA 형태에 따른 유전자 발현 실험을 할 수도 있을 것이다.